發(fā)布時(shí)間：2022-08-09
2022年8月9日，《National Science Review》期刊在線發(fā)表了題為《內(nèi)毛細(xì)胞發(fā)育和轉(zhuǎn)分化依賴(lài)Tbx2》的研究論文，該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心劉志勇研究組完成。該研究揭示了轉(zhuǎn)錄因子Tbx2在耳蝸新生和成年內(nèi)毛細(xì)胞 (inner hair cell, IHC)命運(yùn)決定和轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮重要功能；同時(shí)研究人員利用Tbx2與Atoh1共同異位表達(dá)，成功地將新生小鼠耳蝸支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為表達(dá)功能蛋白vGlut3的內(nèi)毛細(xì)胞 （或類(lèi)IHC），為感音性耳聾的臨床治療提供了新的理論基礎(chǔ)。
內(nèi)毛細(xì)胞位于耳蝸聽(tīng)覺(jué)上皮（又稱(chēng)柯蒂氏器）內(nèi)側(cè)，負(fù)責(zé)把聲音信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，并傳遞到螺旋神經(jīng)節(jié)。因此，內(nèi)毛細(xì)胞的先天發(fā)育異常和后天損傷均會(huì)引起嚴(yán)重的聽(tīng)力障礙。目前聽(tīng)覺(jué)領(lǐng)域內(nèi)有三個(gè)重要問(wèn)題尚未解決：1）內(nèi)毛細(xì)胞是如何分化成熟的？2）成熟內(nèi)毛細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)是如何維持的？3）能否將耳蝸支持細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓摹⒂泄δ艿膬?nèi)毛細(xì)胞？
為了回答上述三個(gè)核心問(wèn)題，本項(xiàng)目研究人員首先利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定出Tbx2是一個(gè)在內(nèi)毛細(xì)胞，而不在外毛細(xì)胞 (outer hair cell, OHC)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子, 并在蛋白水平進(jìn)行耳蝸不同發(fā)育時(shí)期的原位驗(yàn)證 (圖1A-E)。為進(jìn)一步研究Tbx2在內(nèi)毛細(xì)胞中的正常生理功能，研究人員構(gòu)建了Tbx2條件性基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛細(xì)胞在缺失Tbx2后，下調(diào)其功能蛋白基因vGlut3, 并開(kāi)始額外表達(dá)外毛細(xì)胞特異基因Prestin (圖1F-G)。另外，野生型和Tbx2 -/- IHC之間的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)Tbx2 -/- IHC分別有862和442個(gè)基因顯著上調(diào)和下調(diào)，其中上調(diào)的主要包括外毛細(xì)胞基因，而下調(diào)表達(dá)的則主要為內(nèi)毛細(xì)胞基因。該結(jié)果進(jìn)一步證明Tbx2是調(diào)控內(nèi)毛細(xì)胞正常分化的核心基因，缺失Tbx2后內(nèi)毛細(xì)胞將不能進(jìn)行正常分化，反而命運(yùn)轉(zhuǎn)變?yōu)橥饷?xì)胞。因此，Tbx2 -/- IHC也被稱(chēng)作induced OHCs (iOHCs)。Tbx2基因不僅在新生內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá)，而且其表達(dá)水平在成年內(nèi)毛細(xì)胞保持穩(wěn)定 (圖1D-E)。研究人員發(fā)現(xiàn)在成年小鼠成熟內(nèi)毛細(xì)胞內(nèi)敲除Tbx2后，可以誘導(dǎo)出類(lèi)似的命運(yùn)轉(zhuǎn)變表型。因此，Tbx2不僅調(diào)控內(nèi)毛細(xì)胞分化，而且也是維持成年內(nèi)毛細(xì)胞細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵基因。
圖1. IHC缺失Tbx2后轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>iOHC。(A-C) 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示轉(zhuǎn)錄因子Tbx2表達(dá)在IHC，但不表達(dá)在OHC。（D-E）Tbx2蛋白（白色）在新生（P1）和成年（P30）均表達(dá)在IHC，但不表達(dá)在OHC。(F-G) IHC在敲除Tbx2后(黃色箭頭)，vGlut3表達(dá)下調(diào)，同時(shí)Prestin表達(dá)上調(diào)。（H）Tbx2調(diào)控和維持IHC細(xì)胞命運(yùn)的模式圖。
非哺乳類(lèi)動(dòng)物如鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)在聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞損傷后，其支持細(xì)胞可以迅速上調(diào)Atoh1, 再生出新的毛細(xì)胞從而完成聽(tīng)力修復(fù)。但是哺乳類(lèi)動(dòng)物喪失了這個(gè)再生能力。劉志勇研究組構(gòu)建了一種新的小鼠模型 (圖2A)，可以實(shí)現(xiàn)在耳蝸支持細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)Tbx2和Atoh1，并以29.5%的重編程效率將其成功轉(zhuǎn)分化表達(dá)功能蛋白vGlut3的內(nèi)毛細(xì)胞(圖2B-C)。掃描電鏡分析也顯示新生內(nèi)毛細(xì)胞具有和野生型內(nèi)毛細(xì)胞類(lèi)似的纖毛分布特征 (圖2D-E)。該研究結(jié)果顯示Tbx2和Atoh1聯(lián)用產(chǎn)生的新生內(nèi)毛細(xì)胞無(wú)論在數(shù)量上，還是在分化程度上，都較之前單獨(dú)Atoh1過(guò)表達(dá)有顯著的提高。簡(jiǎn)而言之，該研究推動(dòng)了哺乳動(dòng)物耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞再生研究領(lǐng)域的進(jìn)展，為內(nèi)毛細(xì)胞損傷引起的耳聾治療提供了新途徑。
圖2 Tbx2和Atoh1轉(zhuǎn)分化耳蝸支持細(xì)胞為vGlut3+的IHC。(A)新生小鼠耳蝸支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為IHCs的示意圖。(B)對(duì)照組小鼠耳蝸支持細(xì)胞(主要是IBCs/IPhs)只表達(dá)紅色熒光蛋白，但不表達(dá)內(nèi)毛細(xì)胞功能蛋白vGlut3 (白色箭頭)。(C)實(shí)驗(yàn)組小鼠耳蝸支持細(xì)胞同時(shí)表達(dá)紅色熒光蛋白、Tbx2和Atoh1后轉(zhuǎn)變?yōu)?span lang="EN-US">vGlut3+ IHCs (黃色箭頭)。(D-E)掃描電鏡分析表明，與對(duì)照組相比(D)，實(shí)驗(yàn)組小鼠(E)具有額外一排不連續(xù)的IHCs，這些IHCs頂部有纖毛形成（白色箭頭）。
該工作在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育再生研究組劉志勇研究員的指導(dǎo)下，由助理研究員畢政鴻、副研究員李響和博士研究生任旻蕙共同完成。博士研究生顧云鵬、研究助理朱彤、博士研究生李書(shū)亭、王廣琴、孫素紅、孫雨薇對(duì)課題做出了重要貢獻(xiàn)。本研究在論文撰寫(xiě)過(guò)程中得到了腦智卓越中心蒲慕明研究員、杜久林研究員、何杰研究員以及北京大學(xué)于翔教授的指導(dǎo)。中科院腦智卓越中心電鏡技術(shù)平臺(tái)、光學(xué)成像平臺(tái)、分子細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)（實(shí)驗(yàn)鼠房）予以本項(xiàng)目有力支持。該研究得到科技部、中國(guó)科學(xué)院、國(guó)家自然基金委員會(huì)和上海市的支持。
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